Según la tradición, la imagen fue encontrada en el río Paraná por un grupo de pobladores guaraníes, quienes vieron a la Virgen Inmaculada sobre una piedra rodeada de una luz muy brillante.

Fray Gámez ordenó el inmediato traslado de la figura a la Reducción, pero la imagen volvió a desaparecer en dos ocasiones, retornando a su lugar cerca del río.

Los religiosos comprendieron cuál era la voluntad de la Santa Madre y se dispuso el traslado del asentamiento a esos parajes, que luego se comenzaron a denominar Itatí ("Punta de piedra", en esa lengua originaria). Desde entonces, miles de peregrinos visitan cada 16 de julio a María en su enorme basílica, a pocos metros del río Paraná.

El culto a la Virgen de Itatí fue introducido en 1615 por el sacerdote franciscano Fray Luis Bolaños.
La imagen de la Virgen de Itatí está tallada en madera de timbó (el cuerpo) y en nogal (el rostro).
Mide un metro con veintiséis centímetros de altura. Tiene sus manos juntas en posición de oración, viste un manto azul y túnica blanca, y se considera realizada por una artista indígena de una de las tantas reducciones que jalonaban el Alto Paraná.

La Basílica de Itatí es uno de los santuarios más importantes de América. En contraste con su entorno, un sereno pueblo ribereño sin edificios, la construcción es verdaderamente descomunal. Tiene 80 metros de largo y 70 de ancho. Y una cúpula central con un diámetro de 28 metros. En la cúspide, hay una imagen de la Virgen de 7 metros y medio. La altura total es de 83 metros, casi 20 más que el Obelisco de Buenos Aires.